蛋白质是生命活动的核心执行者，其氨基酸序列信息对揭示结构、功能、翻译后修饰等生物学问题至关重要。传统的蛋白质鉴定方法多依赖于数据库匹配，难以应对未知蛋白或翻译后变体的解析。蛋白全长测序（Top-Down或De Novo蛋白测序）技术的兴起，为研究人员提供了更精确、更全面的蛋白序列获取手段。

本文将系统梳理蛋白全长测序的完整工作流程——从样本制备到数据解读，帮助科研人员理解该技术的关键节点与优化策略。

一、样本制备：决定测序质量的第一步

全长蛋白测序对样本质量要求极高。关键步骤包括：

1、蛋白提取与纯化

• 来源多样性：可从细胞、组织、重组表达系统中提取目标蛋白。
• 纯度要求：建议>90%，避免杂蛋白干扰。
• 常用方法：包括SDS-PAGE切胶、亲和纯化（如His-tag、FLAG-tag）等。

2、去盐与缓冲液优化

• 高浓盐和缓冲体系（如Tris）会抑制质谱离子化效率，需通过透析、凝胶过滤或C18固相萃取去除。
• 推荐使用MS兼容性高的缓冲液（如0.1%甲酸水溶液）进行最终重悬。

3、浓度与上样量控制

浓度应控制在0.5–2 μg/μL之间，便于进样稳定。通常需5–20 μg蛋白用于单次测序分析。

二、酶切策略：覆盖全序列的关键设计

蛋白全长测序往往结合多种酶切策略，以提升覆盖度和测序准确性：

• 单酶切（如Trypsin）：生成规则肽段，适合数据库匹配
• 非特异性酶切（如Proteinase K）：打破酶切偏好性，利于De Novo测序
• 多酶并用：通过多平行样本使用不同酶种，形成互补数据集

百泰派克生物科技开发的多酶融合优化流程，显著提升了序列覆盖率和变体识别能力，适用于复杂蛋白的全序列解析。

三、质谱分析：高分辨、高灵敏的核心平台

蛋白全长测序依赖高性能质谱仪的支持：

1、常用平台

（1）Orbitrap Fusion Lumos：高分辨率、高质量数，适合De Novo解析

（2）timsTOF Pro 2：具备串联离子迁移能力，提升肽段鉴定深度

（3）EvoSep One耦合纳流LC：实现低样本量高通量进样

2、分析模式

（1）HCD/CID/ETD串联碎裂：可全面覆盖亲水/疏水肽段及PTMs

（2）MSⁿ模式：提高异构序列鉴定精度

在百泰派克生物科技，我们通过精细化的质谱参数调优，实现平均覆盖度 >90%、N/C端精确率 >95% 的高质量全长序列测定。

四、数据解读与验证：从原始谱图到氨基酸序列

1、De Novo序列解析

采用PEAKS Studio、pNovo、Novor等专业软件进行肽段序列拼接，跨平台比对和手工审阅确保关键区域准确性。

2、序列拼接与修饰识别

拼接多个肽段，获得完整序列，同时识别翻译后修饰（PTMs）如磷酸化、乙酰化、甲基化等。

3、与数据库比对

与Uniprot或自建数据库对比，验证突变位点、新异构体。可用于抗体序列确认、疫苗表位筛选、重组蛋白质量控制等应用场景。

应用价值与百泰派克生物科技优势

蛋白全长测序技术已广泛应用于：

• 抗体序列确认与优化
• 重组蛋白质量控制
• 非模式生物蛋白研究
• 蛋白突变体/剪接体分析

在百泰派克生物科技，我们整合多平台质谱系统与多酶切策略，提供覆盖度高、准确率优、交付周期短的一站式蛋白全长测序服务，已成功支持数十个高水平项目，涵盖药物开发、免疫治疗、合成生物学等领域。

蛋白全长测序是解码功能蛋白结构与变体信息的强大工具。其技术门槛虽高，但通过系统优化各个流程节点——从样本制备到数据解读，研究人员可以获得高质量、可信赖的序列信息。如果您正在寻找可靠的蛋白测序合作伙伴，欢迎联系百泰派克生物科技。我们期待为您的科研项目赋能！

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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